Coloração de Kinyoun: base e técnicas

A coloração de Kinyoun é uma técnica de coloração usada para corar bactérias e parasitas resistentes a ácidos. Nasceu da modificação da coloração de Ziehl-Neelsen; Ambas as técnicas são interpretadas da mesma maneira, mas diferem em dois elementos: na preparação do reagente principal e em que a técnica de Kinyoun não usa calor.

Por esta razão, é também conhecida como coloração a frio de Ziehl-Neelsen ou Kinyoun modificada a frio. É indicado para a coloração de Mycobacterium tuberculosis, Micobacterium leprae, micobactérias atípicas, Nocardias sp, Cryptosporidium parvum, Cryptosporidium meleagridis, Cryptosporidium felis, Cryptosporidium muris e Cyclosporas cayetanensis .

Vale ressaltar que as Nocardias se mancham fracamente com essa técnica, pois são álcool parcialmente resistente a ácidos, portanto, para esse gênero há uma modificação da metodologia.

Por sua vez, a técnica de frio de Kinyoun foi combinada com a técnica tricrômica modificada por Didier para a detecção de coccídios ( Criptosporidium parvum e Isospora belli ) e esporos de microsporídios ( Enterocytozoon bieneusi e Encephalitozoon intestinalis ).

Fundação

O principal reagente de coloração é o carbol fucsina ou fenicaína fucsina, que tem a propriedade de se ligar aos ácidos carbólicos dentro da parede celular cerosa, ricos em lipídios (micólicos) de micobactérias e certos parasitas.

Essa união não é neutralizada pela descoloração ácida; portanto, microorganismos são definidos como álcool resistente a ácidos.

Ao contrário da técnica de Ziehl-Neelsen - que fixa o corante através do calor - na técnica de Kinyoun, essa etapa não é necessária, uma vez que a solução de fucsina fenólica preparada para essa técnica contém uma alta concentração de fenol.

O fenol dissolve o material lipídico da parede celular, o que permite a entrada do corante carbol fucsina. Depois que o corante penetra, ele permanece fixo apesar da lavagem com álcool-ácido.

Desta forma, os microrganismos resistentes aos ácidos assumem a característica cor vermelha, enquanto que tudo o que não é álcool resistente a ácidos torna-se descorado e manchado de azul.

Técnica

Materiais

- Fucsina fenólica modificada.

- Álcool-ácido

- Azul de metileno.

Preparação de fucsina fenicada Kinyoun

- fucsina básica: 4 gr.

- Fenol: 8 ml.

- Álcool (95%): 20 ml.

- Água destilada: 100 ml.

O fucsina básico no álcool deve ser dissolvido lentamente, misturando constantemente. Subsequentemente, o fenol cristalizado é fundido em banho-maria a 56 ° C. Uma vez dissolvidos, são adicionados 8 ml à solução de fucsina preparada acima.

Preparação de álcool-ácido

- Ácido clorídrico concentrado: 3 ml.

Etanol (95%): 97 ml.

Deve ser medido, unido e misturado.

Preparação do corante de contraste azul de metileno

- azul de metileno: 0, 3 g.

- Água destilada: 100 ml.

Ele pesa e se dissolve.

Técnica de mancha Kinyoun

1- Preparar um esfregaço diretamente da amostra, que pode ser expectoração, líquido pulmonar, sedimento urinário, líquido cefalorraquidiano ou fezes, entre outros; ou a partir de uma suspensão de microrganismos obtidos de colônias puras cultivadas em meio de cultura primário.

2- Fixe o esfregaço com calor.

3- Coloque o esfregaço na ponte colorante e cubra com o reagente fenólico de fucsina de Kinyoun preparado. Deixe descansar por 3 ou 5 minutos.

4- Lave com água destilada.

5- Lave com álcool ácido por 3 minutos e lave novamente com água destilada.

6 - Lixívia novamente com álcool ácido por 1 ou 2 minutos até não mais corante é arrastado.

7- Lave com água destilada e deixe escorrer, colocando o escorregador na posição vertical.

8- Cubra a preparação com azul de metileno e deixe por 4 minutos.

9- Lave com água destilada e deixe secar ao ar.

10- Examine a 40X e depois a 100X.

Se você deseja melhorar e acelerar a coloração de microrganismos ácidos-resistentes, adicione 1 gota de um agente umectante (como o tergitol nº 7) a 30 ou 40 ml de fucsina ácida fenílica Kinyoun.

Alguns laboratórios alteram o contraste de azul de metileno para ácido verde-claro ou picrico; o primeiro dá uma cor verde ao fundo e o segundo gera uma cor amarela.

Técnica Kinyoun especial para Nocardias

Para melhorar a coloração da bactéria Nocardia, é usada uma modificação da coloração de Kinyoun. A técnica é a seguinte:

1- Cubra o esfregaço com fucsina fenólica Kinyoun por 3 minutos.

2- Lave com água destilada.

3- Enxagúe rapidamente com 3% de álcool ácido até que não haja mais corante arrastado.

4- Lave novamente com água destilada.

5- Cubra a preparação com azul de metileno e deixe por 30 segundos.

6- Lave com água destilada e deixe secar ao ar.

Técnica combinada de fucsina fenólica e tricrômica modificada por Didier

Esta técnica é recomendada para a análise de amostras de fezes em busca de coccídios e esporos de Microsporidium sp ao mesmo tempo. O procedimento a ser seguido é o seguinte:

1- Cubra o esfregaço com fucsina fenólica Kinyoun por 10 minutos.

2- Retire o corante e lave com água destilada.

3- Lixívia por 30 segundos com ácido clorídrico.

4- Lave novamente com água destilada.

5- Cubra o esfregaço com solução de tricrômio por 30 minutos a 37 ° C.

6- Lave com água destilada.

7- Descolorir por 10 segundos com álcool ácido acético.

8- Lave o esfregaço por 30 segundos usando etanol a 95%.

Controle de qualidade

Como controlo positivo, os esfregaços são preparados com estirpes de Mycobacterium tuberculosis e corados com os reagentes preparados para verificar se as bactérias tomam a cor certa (vermelho-fúcsia).

Controles negativos também podem ser usados ​​preparando esfregaços com qualquer tensão que não seja resistente a álcool ácido, verificando, assim, que toda a amostra recebe a cor do contraste.

Técnica de Kinyoun comparada com a técnica de Ziehl -Neelsen

A técnica de Kinyoun é mais simples porque elimina a etapa de aquecimento, mas sua principal vantagem é que impede a emissão de vapores, altamente tóxicos e causadores de câncer a longo prazo. Portanto, a coloração de Kinyoun é mais segura para o pessoal encarregado da coloração.

É importante levar em conta que é necessário ter cuidado para que os reagentes não entrem em contato direto com a pele, pois são corrosivos e o alvejante é inflamável.

Em relação às desvantagens, um esfregaço negativo não indica necessariamente que o microorganismo não esteja presente. Além disso, a presença de detritos celulares pode causar falsos positivos, o que gera confusão no diagnóstico.

Referência

1. Química Clínica Aplicada (2016). BK Kinyoun Kit. Disponível em: cromakit.es
2. Orozco-Rico Miguel. Mancha de Kinyoun e dois Coccidia no HIV. Revista Médica MD. 2011; 3 (2): 137
3. Forbes B, Sahm D, Weissfeld A (2009). Diagnóstico microbiológico de Bailey & Scott. 12 ed. Argentina Editorial Panamericana SA
4. Koneman E, Allen S, Janda W, Schreckenberger P, Winn W. (2004). Diagnóstico microbiológico. (5a ed.) Argentina, Editorial Panamericana SA
5. Contribuidores da Wikipedia. «Kinyoun stain.» Wikipedia, a enciclopédia livre . Wikipedia, a enciclopédia livre, 8 fevereiro 2018. Web. 5 de janeiro de 2019.
6. Combol A, Fernández N, E Figueredo, Acuña A, Zanetta E. Implementação de uma técnica de coloração para o diagnóstico simultâneo de coccídios e Microsporidia. Instituto de Higiene da Universidade da República. Montevidéu. Uruguai Disponível em: higiene.edu.uy