Proteinase K: características, atividade enzimática e aplicações

A proteinase K é uma enzima que pertence ao grupo das serina-proteases, ou seja, possui no seu centro catalítico ativo um aminoácido serina e tem a função de quebrar as ligações peptídicas por hidrólise. Esta enzima, por sua vez, pertence à família das proteínas subtilisinas (peptidase S8).

A proteinase K tem um peso molecular (PM) de 28.900 daltons e foi isolada pela primeira vez em 1974 a partir de extratos do álbum do fungo Engyodontium, anteriormente conhecido como Tritirachium album Limber.

Apresenta alta capacidade proteolítica, demonstrando ser capaz de degradar a queratina presente no cabelo. A palavra queratina em Inglês é escrito "queratina", por isso tem sido chamado de "proteinase K".

Devido à sua alta capacidade de clivar proteínas nativas, esta enzima é útil em várias técnicas de biologia molecular. É usado principalmente para isolar e preparar ácidos nucléicos com alto peso molecular (MW).

A proteinase K atua liberando o DNA nuclear, ao mesmo tempo em que destrói as proteínas e inativa as RNases e as DNases, ou seja, elimina as nucleases nas preparações de DNA e RNA.

Por outro lado, observou-se que a proteinase K pode hidrolisar algumas proteínas nativas desnaturadas, o que tem despertado o interesse de pesquisadores pelo seu uso no estudo de proteínas priônicas (PrP C).

No entanto, apesar de sua alta potência proteolítica, existem proteínas resistentes à ação da proteinase K. Entre elas, existem algumas proteínas anormais chamadas prions (PrP Sc), associadas a encefalopatias espongiformes transmissíveis.

Características da proteinase K

A proteinase K tem uma estrutura terciária formada por três camadas, com uma folha β de sete cadeias intercaladas entre duas camadas de hélices. Por pertencer à família das peptidases S8, caracteriza-se por possuir uma tríade catalítica em seu sítio ativo, cuja ordem sequencial é (Asp, His e Ser), o que as diferencia de outras famílias de peptidases.

Esta enzima do grupo das proteases de serina é caracterizada pela hidrólise das ligações peptídicas próximas do grupo carboxílico dos aminoácidos alifáticos e aromáticos.

Por outro lado, é capaz de atuar na presença de certas substâncias corrosivas, como o dodecil sulfato de sódio (SDS), o Tris-HCL e o EDTA, que auxiliam na desnaturação das proteínas, fazendo com que elas percam sua estrutura nativa.

Este é um passo preliminar na preparação de proteínas para a técnica de eletroforese. A faixa de pH na qual a proteinase K atua é bastante ampla (2, 0 a 12, 0), com um pH ótimo entre 7, 5 a 12, 0 e seu ponto isoelétrico é de 8, 9. Como pode ser visto, é ativo contra uma gama muito ampla de pH.

Outra característica que se destaca na proteinase K é sua estabilidade na presença de altas temperaturas (50 - 60 ° C).

Atividade enzimática

Proteinase K precisa da presença de íon cálcio, embora isso não afete sua atividade, se é essencial para manter sua estabilidade.

Para que a proteinase K realize a digestão completa do substrato, é necessário um tempo de contato aproximado de 5 minutos a 2 horas.

No entanto, nesse sentido, Daza et al compararam a pureza do DNA obtido em vários momentos de exposição à proteinase K, e concluíram que uma incubação prolongada (até 24 h) melhora significativamente a qualidade do DNA.

Agora, em relação à concentração que é utilizada da enzima proteinase K nos diferentes protocolos, pode-se dizer que ela é muito variada.

Pode ser utilizado desde concentrações muito baixas (5 μg / ml) até concentrações de 500 μg / ml. Mas as concentrações de trabalho mais frequentes variam entre 50-100μg / ml, especialmente para digestão de proteínas e inativação de nucleases. Embora seja necessária uma concentração de 2 mg / ml para o tratamento de tecidos.

Aplicações

Suas aplicações são muito amplas e podem ser resumidas a seguir:

-É usado na digestão de proteínas e extração de DNA por diversos métodos como: salting-out, PK-SDS, brometo de cetil-trimetil amônio (CTAB), acetato de potássio modificado e extração com iodeto de sódio.

-Inativação de nucleases (RNases e DNases).

-Na técnica de hibridização in situ (HIS), para auxiliar na liberação de ácido nucléico, além de eliminar proteínas indesejáveis.

-Modificação de proteínas.

-No nível de pesquisa, em vários estudos.

Vantagens da proteinase K

Vários estudos comparativos foram realizados entre técnicas de extração de DNA usando Proteinase K, com outros que não o utilizam e todos concluem que há maiores benefícios quando se utiliza a enzima. Entre as vantagens, podem ser mencionadas as seguintes:

- DNA de alto peso molecular, alta qualidade e pureza é obtido.

-O DNA extraído é estável por até 3 meses.

O DNA extraído pode ser utilizado nas seguintes técnicas: Southern blot, reação em cadeia da polimerase (PCR), eletroforese, entre outras.

Proteínas resistentes à proteinase K

Várias investigações concluíram que os príons (proteínas tóxicas anormais para PrPSc) são diferenciados das proteínas PrPC (nativas) porque são resistentes à ação da proteinase K, enquanto os PrPC são sensíveis à sua ação.

Outros autores descreveram que na estrutura da PrPSc existem porções sensíveis e outras resistentes à proteinase K. No entanto, ambas as partes são igualmente tóxicas e infectantes.

Por outro lado, Bastian e colaboradores em 1987 isolaram 4 proteínas de 28, 30, 66 e 76 kda de uma espécie de Spiroplasma mirum . Todos eram resistentes à ação da proteinase K e também reagiram de forma cruzada com alguns príons.

Sabe-se que esta espécie pode causar catarata e importantes danos neurológicos e, devido aos achados científicos de Bastian, entre outras investigações, tentou-se relacionar esse microrganismo com as encefalopatias espongiformes transmissíveis.

No entanto, a etiologia dessa patologia neurológica degenerativa ainda é atribuída a prions.

Nesse sentido, Butler e colaboradores identificaram e caracterizaram, em 1991, uma classe de proteínas resistentes à proteinase 40 Kda de duas linhagens de Mycoplasma hyorhinis. Este patógeno afeta os porcos, infectando seus tecidos, mas neste caso não houve reação cruzada com os príons testados.

Mais pesquisas são necessárias para elucidar muitas incógnitas sobre o assunto.