Caldo Malonato: fundação, preparação e usos

O caldo malonato é o meio de cultura líquido utilizado para o teste diagnóstico (teste de malonato), utilizado para diferenciar alguns gêneros da família Enterobacteriaceae. Foi criado por Leifson em 1933 e posteriormente modificado por Ewing, que adicionou uma pequena quantidade de extrato de dextrose e levedura à fórmula original.

O meio é atualmente composto por extrato de levedura, sulfato de amônio, fosfato dipotássico, fosfato monopotássico, cloreto de sódio, malonato de sódio, dextrose e azul de bromotimol. Este teste é geralmente incluído na bateria de identificação bioquímica para enterobactérias, ajudando a diferenciar certos gêneros e espécies.

O teste do malonato baseia-se principalmente na capacidade de alguns microrganismos usarem malonato de sódio como única fonte de carbono e sulfato de amônio como fonte de nitrogênio.

O teste do malonato é geralmente positivo em algumas espécies dos gêneros Enterobacter, Klebsiella e Citrobacter. Enquanto, a maioria das espécies dos gêneros Escherichia, Salmonela, Shigella, Edwardsiella, Yersinia, Serratia, Morganella, Proteus e Providence dão reação negativa.

Fundação

O teste do malonato consiste em demonstrar as bactérias que são capazes de usar malonato de sódio como única fonte de carbono e sulfato de amônio como fonte de nitrogênio.

A maioria das enterobactérias que não usam malonato são capazes de crescer neste meio, tomando dextrose e extrato de levedura como nutrientes.

Neste caso, qualquer tentativa de alcalinizar pelo uso das peptonas será neutralizada pela produção de ácidos gerados pela fermentação da dextrose. Da mesma forma, os fosfatos dipotássicos e monopotássicos atuam como tampão, mantendo o pH em 6, 7.

É por isso que, quando o teste é negativo, o caldo é da mesma cor original (verde). Em casos raros, o meio pode ser acidificado devido à fermentação da dextrose; sem o uso de peptonas e o indicador de pH mudaria a cor do meio para amarelo. Para que isso aconteça, o pH deve cair para 6.

Agora, quando este teste é positivo, diz-se que o microorganismo usava malonato e sulfato de amônio como fontes de carbono e nitrogênio, respectivamente, sem fazer uso dos outros componentes.

Neste caso, o meio torna-se alcalino devido à liberação de sódio e a conseqüente formação de NaOH. Neste sentido, o indicador de pH (azul de bromotimol) muda a cor de verde para azul quando o pH é igual ou maior que 7, 6. O azul pode ser claro ou intenso (azul da Prússia).

Finalmente, o cloreto de sódio mantém a osmolaridade do meio e a água é o diluente de todos os componentes.

Interpretação

Caldo da mesma cor (verde): teste negativo

Caldo amarelo: teste negativo

Caldo azul claro ou intenso: prova positiva

Existe uma variante chamada caldo de malonato de fenilalanina, também chamada de meio Shaw e Clarke. Neste caso, dois testes podem ser analisados, o uso do malonato como fonte de carbono e a produção de ácido pirúvico a partir da fenilalanina.

Preparação

Caldo de Malonato

A quantidade de gramas especificada pela inserção da casa comercial escolhida é pesada (pode variar de uma para outra). Gramas pesadas são suspensas em um litro de água destilada. Aqueça ligeiramente até dissolver completamente. Distribuir 3 ml do meio em tubos de ensaio 13/100 com uma tampa de algodão.

Esterilize em autoclave a 121 ° C por 15 ou 20 minutos.

Esfriar antes de usar. Se não forem utilizados imediatamente, guarde na geladeira até o uso. Tempere os caldos à temperatura ambiente antes de inoculá-los.

O pH do meio deve ser de 6, 7 ± 0, 2. A cor do meio preparado é verde-garrafa.

Caldo de malonato de fenilalanina

Pesar 11 g do meio desidratado e dissolver em 1 litro de água destilada. O resto da preparação é o mesmo que o descrito acima.

Também pode ser preparado adicionando 2 g / l de fenilalanina ao meio de caldo malonato antes de ser esterilizado.

Use

É utilizado como parte da bateria de testes bioquímicos que são montados para a identificação de bactérias da família Enterobacteriaceae.

Ajude a distinguir entre:

-O gênero Klebsiella e Enterobacter (+) dos gêneros Escherichia e Serratia (-).

-As espécies de Salmonella enterica ssp arizonae, Salmonella enterica ssp salame e Salmonella enterica ssp diarizonae (+), da espécie Salmonella enterica ssp enterica (-).

-Do gênero Klebsiella geralmente (+) do gênero Actinobacillus (-).

-Pode, por vezes, ajudar na diferenciação de géneros e espécies de bactérias não pertencentes à família Enterobacteriaceae, como entre os bacilos Gram-negativos não fermentadores Alcaligenes faecalis (+) e Acinetobacter sp (-).

Procedimento

Sob um isqueiro, uma porção de uma colônia pura é tomada, usando uma alça de platina adequadamente esterilizada e resfriada. A amostra retirada (inóculo leve) é dissolvida no caldo de malonato. É incubado com a tampa solta em aerobiose a 35 ° C ± 0, 2 por 24 a 48 horas.

O caldo malonato também pode ser inoculado a partir de uma cultura de 18 a 24 horas em caldo de soja tripticase. Neste caso, toma-se 0, 01 ml com uma pipeta estéril e o caldo de malonato é inoculado. É incubado com a tampa solta em aerobiose a 35 ° C ± 0, 2 por 24 a 48 horas.

No final do tempo, os resultados são interpretados. Qualquer vestígio de cor azul, culminado após 48 horas de incubação, deve ser considerado positivo. O teste não deve ser interpretado como negativo até que o tempo de incubação de 48 horas seja concluído.

No caso da utilização da variante de caldo de malonato de fenilalanina, o malonato é primeiro interpretado e depois são adicionadas 5 gotas de HC1 IN e 3-5 gotas de cloreto férrico a 8%. Uma cor verde escura é interpretada como um teste positivo para a fenilalanina. Se, por outro lado, o meio ficar azul pálido, o teste é negativo para fenilalanina.

Controle de qualidade

Para realizar o controle de esterilidade do meio, um ou dois caldos devem ser incubados a 35 ° C ± 0, 2 por 24 horas de incubação. No final deste período, não deverá haver turbidez nem mudança de cor.

Para o controlo de qualidade, podem ser utilizadas estirpes conhecidas ou certificadas, tais como: Enterobacter aerogenes ATCC 13048, Klebsiella pneumoniae ATCC 33945, Salmonella enterica ssp arizonae ATCC 13314 e Escherichia coli ATCC 25922.

Os resultados esperados são:

  • Enterobacter aerogenes, Klebsiella pneumoniae e Salmonella enterica ssp arizonae dão reação positiva (cor azul média).
  • Para Escherichia coli o resultado deve ser negativo, ou seja, espera-se que não haja alteração na cor (verde) ou que fique amarelo devido à fermentação da glicose.

Limitações

Não use caldo que apresente turbidez, precipitados, mudança de cor ou qualquer sinal de deterioração.