Ágar EMB: fundação, preparação e uso

O ágar EMB é um meio de cultura sólido seletivo e diferencial usado para o isolamento de bacilos Gram-negativos, principalmente da família Enterobacteriaceae, e outros bacilos Gram-negativos não exigentes. Também é conhecido pela sigla EAM, que significa azul de eosina-metileno.

Este meio foi criado por Holt-Harris e Teague em 1916. Contém peptona, lactose, sacarose, fosfato dipotássico, ágar, eosina, azul de metileno e água. É muito semelhante ao ágar MacConkey, especialmente se for utilizado o ágar EMB modificado por Levine, que não contém sacarose.

De fato, cada laboratório decide se trabalha com um ou outro, desde que cumpram a mesma função, embora bioquimicamente sejam diferentes.

Ele ainda apresenta a mesma desvantagem do agar MacConkey clássico em termos de produção de enxames pelo gênero Proteus. Portanto, para evitar esse fenômeno, a concentração de ágar pode ser aumentada em até 5%.

Fundação

Seletiva

O ágar EMB é sutilmente seletivo, pois contém os corantes anilínicos (eosina e azul de metileno), que atuam como inibidores, impedindo o crescimento da maioria das bactérias Gram-positivas e de alguns bacilos Gram negativos exigentes.

No entanto, este agar tem a desvantagem de que algumas bactérias Gram-positivas podem resistir à presença das substâncias inibitórias e crescer como colônias puntiformes pequenas e incolores, como Enterococcus faecalis e alguns Staphylococcus .

Você também pode cultivar certas leveduras, como o complexo Candida albicans, que dará colônias cor-de-rosa muito pequenas. Inclusivamente, os clamidósporos podem ser desenvolvidos a partir desta levedura se a amostra for semeada por profundidade.

Diferencial

Por outro lado, o ágar EMB também é um meio diferencial, uma vez que esses corantes juntos (eosina e azul de metileno) possuem a propriedade de formar um precipitado em pH ácido, portanto servem como indicadores de sua produção.

Portanto, bactérias de lactose ou sacarose de fermentação fraca produzem colônias roxas em 24 a 48 horas. Por exemplo, os gêneros Klebsiella, Enterobacter e Serratia.

As bactérias que fermentam fortemente a lactose, como Escherichia coli, ou sacarose, como Yersinia enterocolitica ou Proteus penneri, formam um precipitado preto-esverdeado, dando um brilho metálico característico nestas espécies.

Deve-se notar que, se for utilizado o meio EMB levine (sem sacarose), Yersinia enterocolitica e Proteus penneri produzirão colônias claras.

Bactérias que não fermentam lactose ou sacarose são nutridas pela presença de peptonas, que fornecem os aminoácidos e nitrogênio necessários para o desenvolvimento bacteriano, e produzem colônias claras. Por exemplo, os gêneros Salmonella e Shigella, entre outros.

Da mesma forma, é importante notar que o gênero Acinetobacter pode apresentar colônias de lavanda azul, mesmo que não seja um fermentador de lactose, nem sacarose, mas eles têm a propriedade de fixar o azul de metileno em sua parede celular. Isso também pode acontecer com outras bactérias oxidativas.

Preparação

O meio desidratado original é bege claro.

Para preparar este meio de cultura, 36 gramas do meio desidratado devem ser pesados ​​e suspensos em um frasco contendo um litro de água destilada.

Depois de deixar a mistura por 5 minutos em repouso, leve a fiola a uma fonte de calor, misturando vigorosamente e constantemente até ferver e dissolver completamente.

Subsequentemente, o meio de cultura já dissolvido deve ser esterilizado utilizando a autoclave a 121 ° C durante 15 minutos.

No final do tempo, é removido da autoclave e deixado para descansar brevemente. Em seguida, é servido até quente (45 - 50 ° C) entre 15 a 20 ml de ágar em cada placa de Petri estéril. O meio deve ser azul claro.

Depois de servir as placas são deixadas ligeiramente descobertas até que a ágar esfrie um pouco. Então eles são cobertos e autorizados a solidificar completamente. Mais tarde, eles são pedidos em um suporte de placa invertida e armazenados em um refrigerador (8 ° C) até o uso.

Este procedimento é preferencialmente realizado em um capô de fluxo laminar ou na frente do queimador de Bunsen para evitar a contaminação.

É importante ter em mente que cada casa comercial indicará a quantidade a ser pesada para preparar o meio de cultura.

O pH final do meio deve ser de 7, 2 ± 0, 2

Usos

Este meio é usado para semear urina e fezes ou qualquer tipo de amostra clínica, especialmente se houver suspeita de bacilos Gram-negativos não exigentes, como bacilos pertencentes à família Enterobacteriaceae, que cresce muito bem nesse meio.

As bactérias enteropatogênicas dos gêneros Shigella e Salmonella são diferenciadas por suas colônias incolores ou levemente ambaradas.

Outros bacilos lactose não fermentadores também crescem, como Aeromonas, Pseudomonas, Acinetobacter, entre outros.

Da mesma forma, este meio é muito útil na análise microbiológica de alimentos e água, pois é ideal para a fase confirmatória completa da determinação de coliformes, isto é, para corroborar a presença de E. coli de caldos EC turbinados, de da técnica de número mais provável (NMP).

Controle de qualidade

Para verificar se o meio de cultura recém-preparado funciona bem, as linhagens de controle podem ser plantadas para observar as características das colônias e verificar se estão em conformidade com o esperado.

Para isto, podem ser utilizadas estirpes ATCC ou estirpes bem identificadas de E. coli, Enterobacter aerogenes, Klebsiella sp, Salmonella typhimurium, Shigella flexneri, Pseudomonas aeruginosa e algumas bactérias Gram-positivas, como S. aureus .

Espera-se que a E. coli gere colônias preto-azuladas bem desenvolvidas com brilho metálico verde. Considerando que Enterobacter aerogenes e Klebsiella sp devem produzir colônias mucosas negras azuladas bem desenvolvidas.

Por outro lado, Salmonella typhimurium e Shigella flexneri, devem desenvolver grandes colônias, incolores ou com uma leve cor âmbar.

Finalmente, o gênero Pseudomonas aeruginosa cresce como colônias incolores de tamanho irregular, enquanto as bactérias Gram-positivas devem ser totalmente inibidas ou crescer moderadamente com colônias muito pequenas.

Considerações finais

Às vezes, a esterilização reduz o azul de metileno, observando um meio laranja. Para que o azul de metileno oxide e a cor púrpura se recupere, ele deve ser misturado suavemente até que a cor se recupere.

Além disso, após a esterilização, o corante pode precipitar, por isso deve ser bem misturado antes de servir as placas de Petri.